11147nam a2200314 a 4500001000800000005001100008008004100019100002200060245022000082260001600302300001100318500008200329520101780041165000231058965000091061265000101062165000121063165000121064365000221065565000101067765000111068765000231069865000231072165000171074465300101076165300131077165300201078465300281080415387602019-11-22       2001    bl uuuu  m   00u1 u    #d1 aGARRIDO, L. da R.  aIdentificação, desenvolvimento e uso de marcadores de regiões hipervariáveis do genoma de Magnaporthe grisea na análise da estrutura de populações do patógeno infectando plantações de arroz (Oryza sativa).  a2001.c2001  a188 f.  aTese (Doutorado em Fitopatologia) - Universidade de Brasília, Brasília, DF.  aA brusone do arroz, causada por Magnaporthe grisea (anamorfo Pyricularia grisea), e considerada uma das mais importantes doenças de culturas cultivadas em todo o mundo, tendo em vista que o arroz representa a principal fonte alimentar de boa parte da população da Terra. O fungo apresenta uma ampla distribuição geográfica e alta capacidade destrutiva. Apesar das diversas décadas de pesquisa, o controle deste fungo tern sido difícil no campo, pelo surgimento de isolados resistentes a antibióticos e a fungicidas nas décadas de 60 a 80, bem como a quebra precoce da resistência de cultivares oriundos de programas de melhoramento. Vários cultivares de arroz foram desenvolvidos através dos cruzamentos com fontes de resistência a brusone e após anos de avaliação foram liberados para plantio em diversos países. Entretanto, em pouco tempo epidemias de brusone inviabilizaram a continuação da utilização destes materiais. Durante um bom tempo o foco da atenção de melhoristas e fitopatologistas foi a planta hospedeira, colocando o segundo componente para ocorrência de doença (o patógeno) em segundo piano. Na região do Formoso do Araguaia, TO, fronteira de expansão do plantio do arroz irrigado do Brasil a partir da década de 80, local com excelentes condições ambientais tanto para o desenvolvimento do arroz quanta para o patógeno, tem-se observado a quebra da resistência das novas cultivares pouco tempo após o lançamento. E grande, pois, a necessidade de compreender as variáveis que conduzem a este fenômeno, e pode tomar incompatível ou mesmo inviabilizar o plantio a tango prazo de arroz nesta nova fronteira. Entre as variáveis associadas a quebra de resistência, por certo a variabilidade genética do patógeno e a estrutura genética das epidemias na região tern papel relevante. O estudo de variabilidade genética do patógeno requer, no entanto, tecnologia que possibilite a detecção e quantificação de diferenças genéticas herdáveis entre os indivíduos (isolados monospóricos) que compõem a população. Esta tecnologia para ser adequada, entre outros fatores, deve amostrar a população em regiões herdáveis do genoma, detectar polimorfismo em abundância permitindo a discriminação de indivíduos, permitir estimativas de variabilidade genética rápidas, a um custo baixo, em grande volume e contínuas (ano a após ano, possibilitando o monitoramento do patógeno). A inexistência deste tipo de marcador molecular para M. grisea estimulou o primeiro Capitulo "Descobrimento, desenvolvimento e utilização de microssatélites para analise genética de isolados de Magnaporthe grisea", voltado para o desenvolvimento de marcadores microssatélites para o estudo de populações do patógeno. a segundo Capitulo "Monitoramento da variabilidade genética e analise da estrutura de populações de M. grisea com marcadores de regiões hipervariáveis do genoma" focalizou no uso desta tecnologia para o estudo de variabilidade genética e estrutura de populações de isolados do patógeno obtidos na região de Formoso do Araguaia, bem como urn conjunto de isolados coletados em todo o Brasil. No Capitulo I descreve-se o desenvolvimento de bibliotecas genômicas enriquecidas para sequência satélite, o descobrimento de clones com microssatélites, o desenvolvimento de marcadores destas regiões hipervariáveis e o uso da tecnologia em estudos genéticos. Foram caracterizados 41 marcadores microssatélites inéditos de M. grisea, com a possibilidade de utilização imediata de uma bateria de 13 STRs, caracterizada com uma ampla coleção de isolados do patógeno. a poder de discriminação combinado observado dos 13 marcadores STR foi estimado em 7,17 x 10-15. as marcadores STR podem substituir ou complementar os marcadores ate então utilizados (Pot 2 e MGR-586), que embora relativamente eficientes nos estudos da variabilidade do patogeno, apresentam uma serie de desvantagens, dificultando sua utilização. Também mostrou-se altamente eficiente na discriminação de isolados com alta dissimilaridade genética (coletados em todo o pais), bem como daqueles pertencentes a populações com alta similaridade genética. as trabalhos envolvendo marcadores STR podem ser facilitados através da utilização de sistemas multiplex, onde primers marcados com fluorescências diferentes sac amplificados e/ou analisados conjuntamente e submetidos a eletroforese propiciando redução dos gastos com as analises, escalonamento na geração de dados, monitoramento continuo e acurácia na determinação alélica. Urn estudo de variabilidade genética e estrutura de populações de isolados de M. grisea coletadas na região de Formoso do Araguaia foi desenvolvido no Capitulo ll com a bateria de 13 STRs desenvolvidos para M. grisea. Primeiramente uma extensa coleção de isolados monospóricos do patógeno foi estabelecida, representando acentuadamente a nova fronteira rizícula no Vale do Araguaia, alem de incluir isolados de todas as partes do Brasil. A bateria de marcadores STR foi altamente informativa e reveladora na analise da variabilidade genética e estrutura de populações de M. grisea. Grande parte da variabilidade genética observada nas nove populações de M. grisea estudadas encontra-se dentro das populações e não entre populações. Diferenças significativas entre as populações foram observadas em todas as comparações par-a-par. A alta variabilidade genética dos isolados estudados e provavelmente uma das razoes para a rápida quebra de resistência de variedades de arroz lançadas na região. Considerando-se que em cada população foram observados perfis multilocos idênticos entre alguns poucos isolados, a diversidade de perfis multilocos indica a existência da fase sexual ou parassexual do patógeno nas condições de cultura de arroz irrigado no Vale do Araguaia. Os isolados de M. grisea obtidos em todo 0 Brasil foram cIassificados em três grandes grupos através da genotipagem com a bateria de 13 STR: (1) isolados obtidos de arroz irrigado, (2) isolados de arroz de sequeiro e (3) isolados patogênicos a outras gramíneas. Estes dados sac reveladores na medida em que" evidencia-se urn processo de co-evolução patógeno-hospedeiro caracterizado pelos distintos pools gênicos desenvolvidos ao longo do processo de domesticação do arroz cultivado (Oryza sativa). Consequentemente, 0 melhoramento genético de arroz deve procurar fontes de resistência para isolados obtidos de arroz tipo indica em pools gênicos de japonica ou parentes silvestres, e vice-versa. The rice blast caused by Magnaporthe grisea (anamorfo Pyricularia grisea), is considered one of the most important disease of the cultivated crops all over the world, whereas rice represents the main food source of a considerable part of the Earth population. The fungi shows a wide geographic distribution and a high harmful capacity (destructive). In spite of several decades of research, the control of this fungi in the field has been hard, because of the appearance of resistant isolates to antibiotics and fungicides in the 60 and 80 decades, as well as the early cultivar resistance broke originated from breeding programs. Several rice cultivars were developed through crosses with sources of resistance to rice blast and after years of evaluation were released to be planted in many countries. However, in a short period, blast rice epidemics made the use of this materials impracticable. During a long time the focus of the breeders and plant-pathologists attention was the host plant, putting the other component of disease occurrence (the pathogen) in the second plan. Formoso do Araguaia region, TO, an expansion frontier of the irrigated rice planting of Brazil is an excellent environment both to the development of rice and pathogen. There, resistance broke of new cultivars right after their releasing has been observed. It is noticeable, hence, the necessity to understand the variables that lead to this phenomenon, and can become incompatible or make the rice long term planting impractical in this 'new frontier. Among these variables associated to resistance broke, for certain the pathogen genetic variability and genetic structure of epidemics in the region have a relevant role. The study of pathogen genetic variability demands, though, technology that makes possible the detection and quantification of heritable genetic differences between the individuals (monoconidial isolates) that compose the population. To be adequate, this technology must, between other factors, sample the population in heritable regions of the genome, detect abundant polymorphism allowing the individual discrimination, allow fast genetic variability estimates, in a low cost, in huge volume and continuosly (year after year, making possible the pathogen monitoring). The non-existence of this sort of molecular marker to M. grisea encouraged the first Chapter "Discovering, development and use of microsatellites for the genetic analysis of Magnaporthe grisea", concerned to the development of microsatelite markers for the study of pathogen populations. The second Chapter "Monitoring of genetic variability and analysis of the structure of M. grisea populations with hypervariable region markers of the genome" aimed the use of this technology for the genetic variability study and population structure of the pathogen isolates obtained in the Formoso do Araguaia region, as well as an amount of isolates collected all over Brazil. In the first Chapter, it is described the development of genomic libraries enriched for satellite sequences, the discovering of microsatellite clones, the development of markers from these hypervariable regions and the use of the technology in genetic studies. Forty-one unpublished microsatellite markers were developed, with the possibility of immediate use of a battery of 13 STRs, characterized with a wide pathogen isolate collection. The power of combined discrimination observed for the 13 STR markers was estimated in 7.17 x 10-15. STR markers can replace or complement the markers used until today (Pot 2 and  aMagnaporthe grisea  arice  aArroz  aBrusone  aDoença  aDoença de Planta  aFungo  aGenoma  aMarcador Genético  aMarcador Molecular  aOryza Sativa  aBlast  aControle  aHipervariáveis  aVariabilidade genética