03375nam a2200145 a 450000100080000000500110000800800410001910000230006024501390008326000160022230000100023850001100024852028490035865000220320715138992011-04-18       2009    bl uuuu  m   00u1 u    #d1 aROLLA, A. A. de P.  aDesenvolvimento e validação de um método de determinação do número de cópias transgenes no genoma da soja por PCR quantitativo.  a2009.c2009  a75 f.  aDissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Londrina, Londrina.  aAs ferramentas de biotecnologia têm proporcionado nos dias atuais o desenvolvimento de organismos geneticamente modificados (OGMs), sejam microorganismos, plantas ou animais. Plantas geneticamente modificadas (PGM) possibilitam a solução de problemas na produção, agregando valor aos produtos agrícolas e em varias situações, oferecendo alternativas importantes para a melhoria na qualidade de vida humana e do ambiente. Após a obtenção de plantas GM, a caracterização molecular dos eventos constitui uma etapa essencial para a identificação das linhagens mais promissoras, que venham constituir o evento GM elite, a ser utilizado como linhagem parental no programa de melhoramento. A caracterização molecular quanto ao número de cópias do transgene, bem como do sitio de inserção, permite inferir sobre a estabilidade do genoma receptor após a transformação gênica. Este trabalho teve como principal objetivo avaliar a eficácia da quantificação do número de cópias transgenes no genoma da soja utilizando a metodologia de PCR quantitativo (qPCR) comparando-a à técnica pioneira de Southern blotting. Foram testados 2 sistemas de quantificação por qPCR por quantificação relativa, baseados em DNA genômico, um que empregou a fórmula 2-aact,  utilizando uma amostra com número de cópias do transgene conhecida como calibradora; e outro, que utilizou a própria referencia endógena como calibrador, através da formula 2-act/2. Além destes, plasmídeos recombinantes, contendo as regiões de interesse (transgene) e parte do gene da lectina clonados, foram utilizados para a construção de curvas de calibração para determinação do número absoluto de cópias do transgene no genoma da soja. Para determinação da exatidão dos diferentes sistemas os resultados foram comparados com os obtidos através da técnica de Southern blot. Nove eventos GM contendo o gene DREB1A tiveram o número de cópias dos cassetes transgenes quantificados via qPCR por quantificação relativa. De acordo com os resultados, 9 eventos tiveram o número de cópias dos cassetes determinados pelas duas metodologias de qPCR por quantificação e confirmados por Southern blot. Os resultados demonstraram que ambos os métodos de quantificação relativa possibilitaram a quantificação exata do número de cópias do transgene no genoma das amostras testadas. O emprego da própria referencia endógena como calibradora foi mais precisa, uma vez que elimina variações na amplificação que possam ocorrer entre amostra/calibrador. Tais resultados indicam a potencialidade, além da praticidade e rapidez, do emprego da técnica de qPCR para realizar o screening inicial de plantas GM na seleção de eventos com baixo número de cópias, e, consequentemente, na aceleração do desenvolvimento de eventos GM elites.  aGenética Vegetal