06693nam a2200193 a 450000100080000000500110000800800410001910000180006024501660007826001490024450001680039352057870056165000220634865000220637065300210639265300270641365300230644065300360646321275942020-12-03       2020    bl uuuu  m   00u1 u    #d1 aDINATO, N. B.  aViabilidade de grãos de pólen de espécies de Paspalum após a criopreservação visando seu uso em programas de melhoramento genético.h[electronic resource]  a2020, 164 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de São Carlos, São Carlosc2020  aOrientador(a): Profª. Drª. Alessandra Pereira Fávero, Embrapa Pecuária Sudeste. Coorientador(a): Drª. Bianca Baccili Zanotto Vigna, Embrapa Pecuária Sudeste.  aPaspalum é um gênero da família Poaceae, nativo da América, do qual muitas espécies apresentam potencial forrageiro. A alta diversidade genética natural observada no gênero pode ser utilizada para a obtenção e lançamento de novas cultivares. Para que ocorra a hibridação, uma das premissas é que o período de floração entre os genitores seja sincronizado. A coleta de pólen do genitor masculino e o armazenamento até que o genitor feminino esteja apto é uma alternativa para florescimento assíncrono. Este estudo visou determinar a morfologia polínica e a viabilidade de grãos de pólen de Paspalum atratum, P. malacophyllum e P. regnellii criopreservados por 12 meses e seu uso em cruzamentos intra e interespecíficos, confirmando assim sua viabilidade in vivo. Os grãos de pólen foram coletados em vasos em casa de vegetação, na Embrapa Pecuária Sudeste, com três repetições de cada tratamento. Foram testados dois agentes de desidratação (LiCl e Sílica gel) por três tempos distintos (30', 60' e 120') e um tratamento sem desidratação. Após descongelamento lento, os grãos de pólen foram avaliados quanto à viabilidade por coloração com solução de tetrazólio 0,25%. Grãos recém-colhidos também foram avaliados como controle. Observou-se que os grãos de pólen permaneceram viáveis após 12 meses quando foram desidratados com cloreto de lítio por 30 minutos e sílica gel por 120 minutos, sendo que foram iguais estatisticamente à testemunha. Tais tratamentos podem ser considerados como bons protocolos de conservação a longo prazo do pólen de Paspalum. Os grãos de pólens criopreservados foram também testados quanto à viabilidade in vivo, sendo observados em microscopia de fluorescência. Os seguintes cruzamentos intra e interespecíficos foram realizados entre janeiro e fevereiro de 2018: P. urvillei (BGP 393) x P. malacophyllum (BGP 6; BGP 293); P. urvillei x P. regnellii (BGP 215, planta F1 #37 (P. plicatulum 4PT x P. guenoarum cv. Azulão) x P. atratum (BGP 98; BGP 308). As espiguetas foram retiradas periodicamente, por tempos distintos após a polinização, fixadas em solução de F.A.A. (1: formaldeído, 1: ácido acético glacial, 8: álcool etílico 80%) por 30 minutos e armazenadas em etanol 70%. Observou-se que em todos os cruzamentos houve efetiva germinação dos grãos de pólen e que em alguns cruzamentos o tubo polínico alcançou a micrópila. Para a caracterização morfológica polínica foi realizada acetólise láctica e fotomicrografia em MEV (microscopia eletrônica de varredura). O resultado das análises morfométricas mostrou que os grãos de pólen tiveram forma de prolato-esferoidal e subprolato, que não há ornamentação na exina e que há pouca diferença quanto ao tamanho entre as espécies avaliadas. Como comprovação da viabilidade e eficácia dos grãos de pólen criopreservados, esses foram utilizados em cruzamentos intra e interespecíficos a fim de elucidar a capacidade do grão produzir sementes viáveis e possibilitar a hibridação entre espécies de Paspalum com uso de grãos de pólen criopreservados. Os grãos de pólen ficaram armazenados em nitrogênio líquido por cerca de 12 meses, quando foram realizados cruzamentos entre diferentes espécies nas combinações: (1) P. urvillei (BGP 393) x P. malacophyllum (BGP 6; BGP 293); (2) P. urvillei (BGP 393) x P. regnellii (BGP 215); (3) 366_C 33 (P. regnellii/ BGP 258 x P. regnellii /BGP 397) x P. malacophyllum (BGP 293), (4) 365_C 33 (P. regnellii/ BGP 258 x P. regnellii /BGP 397) x P. regnellii (BGP 215); (5) P. regnellii (BGP 258) x P. regnellii (BGP 215); (6) plantas F1 #10, F1 #4, F1 #37 e F1 #42 (P. plicatulum 4PT x P. guenoarum cv. Azulão) x P. atratum (BGP 98; BGP 308) e (7) plantas F1 #10 e F1 #37 (P. plicatulum 4PT x P. guenoarum cv. Azulão) x P. malacophyllum (BGP 293). Foram polinizadas 5850 espiguetas em todas as combinações, que resultaram em 830 cariopses, das quais 445 plântulas germinaram. Foi realizada a caracterização morfológica das progênies com base em descritores morfológicos de Paspalum. Os genitores masculinos e femininos compartilhavam características semelhantes e x em alguns cruzamentos, não foi possível diferenciar os híbridos por morfologia. Em nenhum cruzamento foi possível realizar a análise multivariada baseada em componentes principais. Logo, para confirmar o caráter hibrido dos indivíduos, foi realizada análise pelo uso de marcadores microssatélites (SSR) e inter-microssatélites (ISSR). Marcadores moleculares foram selecionados na literatura com base nas espécies para os quais foram desenvolvidos e/ou avaliados. Observou-se que, dos sete marcadores ISSR testados, cinco conseguiram diferenciar os genitores de alguns cruzamentos: (CT)8-G, (AC)8-T, (CA)8-G, (ATG)5-GA e (GA)8-C, e, dos 50 SSR selecionados, 16 diferenciaram os genitores dos cruzamentos realizados. Foram avaliados, pelo menos, quatro marcadores polimórficos para cada cruzamento. Foram identificados 73 híbridos no total, incluindo todos os cruzamentos realizados. Diante dos resultados é possível concluir que grãos de pólen de Paspalum possuem alta viabiliade após criopreservação por até 365 dias, se desidratados com cloreto de litio e/ou silica gel. A microscopia de fluorescência mostrou que grãos de pólen criopreservados germinaram com eficácia em estigma e em alguns casos, a micrópila foi atingida. Em cruzamentos intra e interespecíficos utilizando esses grãos de pólen, foi possível identificar híbridos com uso de marcadores moleculares, portanto grãos de pólen criopreservados podem ser usados em programas de melhoramento genético para possibilitar a sincronia entre espécies de florescimento assíncrono.  aPaspalum urvillei  aCriopreservação  aPaspalum atratum  aPaspalum malacophyllum  aPaspalum regnellii  aViabilidade de grãos de pólen