05381nam a2200169 a 450000100080000000500110000800800410001910000180006024501410007826000160021930000080023550002850024352046290052865300150515765300240517265300150519621095902020-04-20       2019    bl uuuu  m   00u1 u    #d1 aGARCIA, M. B.  aCulturas enriquecidas para degradação de ligninabdiversidade microbiana e triagem de biblioteca metagenômica.h[electronic resource]  a2019.c2019  a102  aDissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia. (Orientadora: Dra Betania Ferraz Quirino)  aO desenvolvimento sustentável tem sido bastante discutido no mundo e no Brasil, principalmente quando se trata das biorrefinarias produzidas a partir do material lignocelulósico. Esse material é formado basicamente de celulose, hemicelulose e lignina. Porém, sabe-se que apenas as duas primeiras são utilizadas, restando a lignina, que é uma matriz heteropolimérica complexa e acaba sendo queimada por ser de difícil bioconversão. Existem alguns fungos e bactérias capazes de degradar compostos aromáticos, incluindo a lignina. Contudo, a diversidade microbiana vai muito além do que conhecemos dentro do laboratório, pois alguns microrganismos não são facilmente cultivados. Previamente a este trabalho, foram produzidos consórcios microbianos enriquecidos para microrganismos capazes de degradar lignina a partir da comunidade presente no solo de jardim. O solo foi inoculado em meio mínimo M9 com lignina kraft ou lignina extraída por método alcalino como fonte de carbono, em duas temperaturas (30˚C ou 37˚C). A cada duas semanas, uma alíquota foi transferida para um novo meio, perfazendo-se seis passagens. Além disso, uma biblioteca metagenômica foi construída com o DNA do consórcio da sexta passagem cultivada com lignina kraft a 37°C. Os objetivos deste trabalho foram: avaliar e comparar a diversidade bacteriana e fúngica encontrada nas sucessivas passagens durante o enriquecimento; e realizar a busca por enzimas capazes de degradar lignina na biblioteca metagenômica. Para tal, foram obtidas amostras de DNA das passagens e foi realizado um sequenciamento de iTags do gene rRNA 16S de bactérias e da região ITS de fungos. A partir das sequências obtidas, foram realizadas análises utilizando o software QIIME para cálculo dos índices de riqueza e diversidade: Chao1, Shannon-Wiener, Simpson, Good?s coverage e Phylogenetic Diversity (PD). Adicionalmente, foram construídas curvas de rarefação, levando em consideração o número de OTUs observadas em cada consórcio. Ambas as análises mostraram que o solo original era extremamente diverso e que, conforme as passagens foram ocorrendo, a riqueza e diversidade diminuíram. Também foram gerados gráficos de composição taxonômica dos consórcios para analisar a dinâmica das comunidades. Os gráficos apontaram que os microrganismos ali presentes se tornaram específicos, conforme as passagens foram ocorrendo, de acordo com o substrato e a temperatura, mostrando que houve uma seleção dentro das comunidades, favorecendo classes específicas em cada situação. Todas as classes dominantes na sexta passagem já foram descritas como degradadoras de lignina, sugerindo que o enriquecimento foi suficiente para selecionar os microrganismos capazes de degradar lignina presentes no solo de jardim inicial. Foram gerados gráficos de Escalonamento multidimensional não métrico (NMDS) bacterianos e fúngicos, com a finalidade de identificar a dissimilaridade entre as amostras analisadas. Para bactérias, o substrato e a temperatura foram fatores de grande relevância na diferenciação das comunidades. Já com relação aos fungos, o substrato como a temperatura tiveram pouca influência na diferenciação entre os consórcios. Adicionalmente, a biblioteca metagenômica foi inserida em dois hospedeiros, Escherichia coli HB101 e Pseudomonas putida KT2440 e, posteriormente, foi realizada uma triagem utilizando guaiacol como substrato. Em E. coli HB101, foi possível identificar três clones positivos potencialmente capazes de degradar o substrato utilizado. Após sequenciamento destes clones, suas ORFs foram analisadas. A ORF3 pertencente ao clone p8_a4 apresentou similaridade com a enzima ácido graxo desaturase, pertencente a Altererythrobacter sp. A reação catalisada por esta enzima utiliza-se do O2 e de um par de elétrons, liberando água. Isso também ocorre durante a reação de oxidação do guaiacol promovida pela lacase. Sendo assim, é possível que essa enzima esteja realizando a oxidação do guaiacol. Após a análise dos outros dois clones, não foi possível identificar qual a ORF potencialmente é responsável pelo fenótipo de oxidação de guaiacol. Apesar das dificuldades encontradas, foi possível realizar o enriquecimento de comunidades de microrganismos que provavelmente estão degradando lignina. Além disso, a partir de uma biblioteca metagenômica, foram triados três clones positivos que possuem o fenótipo para oxidação do guaiacol e, futuramente, poderão ser amplamente estudados e, possivelmente, aplicados durante a degradação da lignina.  aBactérias  aEcologia Microbiana  aMetagenoma