04783nam a2200229 a 450000100080000000500110000800800410001910000190006024501820007926000160026130000110027750001770028852039370046565000210440265000330442365000170445665000220447365000130449565000100450865000260451865000090454420851002018-01-11       2017    bl uuuu  m   00u1 u    #d1 aRINCÃO, M. P.  aTranscriptoma in planta de Phakopsora pachyrhizi e caracterização funcional de genes envolvidos em mecanismos basais de sobrevivência e patogenicidade.h[electronic resource]  a2017.c2017  a212 p.  aTese (Doutorado) - Universidade Estadual de Londrina, Londrina. Orientador: Prof. Dr. Ricardo Vilela Abdelnoor. Co-orientadora: Dra. Francismar Correa Marcelino-Guimarães.  aO Brasil é o segundo maior produtor mundial de soja (Glycine max (L) Merrill), produto responsável por metade da produção agrícola nacional. Entretanto, a produção dessa importante oleaginosa é afetada, dentre outros fatores, pela ação do fungo Phakopsora pachyrhizi (Sydow & P. Sydow), causador da doença conhecida como ferrugem-asiática da soja (FAS). Por ser um fungo biotrófico obrigatório, o estudo de P. pachyrhizi é limitado ao seu contato com o hospedeiro durante o processo de infecção. Neste sentido, este trabalho utilizou a técnica de microdissecção a laser da lesão foliar, associada ao sequenciamento de alto desempenho, para a obtenção de sequências de transcritos do patógeno durante a interação com genótipos resistente e suscetível de soja (PI561356 e BRS 231, respectivamente). Os resultados obtidos através do sequenciamento do transcriptoma do fungo compreendem a identificação de 36.350 unisequências de P. pachyrhizi, que forneceram uma visão geral dos mecanismos moleculares e rotas biológicas ativas no patógeno aos dez dias após a infecção em soja, como metabolismo energético e de ácidos nucleicos, síntese proteica, além de processos de transcrição, biossíntese e transporte. Transcritos relacionados a processos de exocitose, sinalização de vias metabólicas, dentre outros, se apresentaram enriquecidos entre os genótipos resistente e suscetível utilizados neste trabalho em relação ao transcriptoma obtido de P. pachyrhizi. Adicionalmente, transcritos relacionados a processos de metilação, transporte de sulfato, e resposta a espécies reativas de oxigênio, entre outros, também foram enriquecidos entre diferentes estruturas e fases de infecção do fungo como esporos germinados, apressório, haustório e lesão foliar. Análises OrthoMCL comparando as unisequências geradas a partir do genoma de outras 15 espécies de fungos e oomicetos, incluindo outras espécies de ferrugens, identificaram famílias multigênicas conservadas entre as espécies analisadas, bem como famílias comuns a fungos causadores de ferrugens, e famílias encontradas exclusivamente em P. pachyrhizi, com destaque para famílias relacionadas a sinalização de vias metabólicas e transportadores de membrana. A predição de elementos de transposição ativos entre os 36.350 transcritos, identificou diferentes famílias de retrotransposons e de transposons de DNA, e análises de RTqPCR confirmaram os níveis de expressão de genes específicos observados no sequenciamento de alto desempenho. Adicionalmente, sete genes potencialmente envolvidos em processos de sobrevivência e patogenicidade de P. pachyrhizi, selecionados a partir do transcriptoma do fungo e de análises in silico, foram caracterizados funcionalmente via silenciamento gênico por RNA interferente. Mediante a utilização da tecnologia de silenciamento gênico induzido pelo hospedeiro (Host-Induced Gene Silencing - HIGS), construções utilizando 12 plasmídeos baseados no genoma do vírus do mosqueado do feijoeiro (Bean pod mottle vírus - BPMV) foram obtidas para os sete genes do fungo previamente selecionados. As construções HIGS-BPMV foram inseridas em plantas suscetíveis de soja, e posteriormente inoculadas com P. pachyrhizi. Os resultados obtidos revelaram redução significativa nos níveis de transcritos e na patogenicidade do fungo para três dos sete genes silenciados. Os resultados obtidos neste trabalho contribuem com o aumento do conhecimento sobre o transcriptoma do fungo P. pachyrhizi, demostram a existência de uma maquinaria de silenciamento ativa nesse patógeno, e, consequentemente, que o silenciamento gênico baseado na técnica de HIGS-BPMV constitui uma ferramenta viável na caracterização funcional de genes do fungo, sendo identificados pelo menos três genes que ocasionaram reduções significativas na patogenicidade quando silenciados.  aMicrobial growth  aPlant diseases and disorders  aSoybean rust  aDoença de planta  aFerrugem  aFungo  aPhakopsora pachyrhizi  aSoja