03569nam a2200145 a 450000100080000000500110000800800410001910000230006024501830008326000160026630000110028250001430029352029630043665000240339920663162017-03-15       2015    bl uuuu  m   00u1 u    #d1 aCARVALHO, C. E. G.  aIdentificação de potenciais imunógenos de Corynebacterium pseudotuberculosis e avaliação de vacinas de DNA e de subunidade contra linfadenite caseosa.h[electronic resource]  a2015.c2015  a108 f.  aTese (Doutorado em Ciência animal) - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande. Orientadora: Grácia Maria Soares Rosinha.  aA linfadenite caseosa (LC) é uma enfermidade que afeta ovinos e caprinos e ocasionalmente o homem, causada pela bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis. A LC é uma das doenças de grande importância econômica na ovinocultura e caprinocultura. Vacinas comerciais disponíveis não oferecem proteção adequada aos animais. Portanto, o desenvolvimento de vacinas mais eficientes contra LC é necessário. Desta forma, objetivou-se com este estudo construir uma biblioteca de expressão gênica de C. pseudotuberculosis e identificar, por imunovarredura, genes que codificam possíveis proteínas antigênicas para o desenvolvimento e avaliação de vacinas de DNA e subunidade contra LC. Uma cepa selvagem de C. pseudotuberculosis foi utilizada para a extração e digestão parcial do DNA genômico. Sequências entre 1.000 e 5.000 pares de bases foram cortadas do gel, purificadas e os fragmentos obtidos do DNA digerido foram ligados no vetor bacteriófago ZAP Express, empacotados em fagos e transfectados em Escherichia coli. Para a imunovarredura utilizou-se um pool de soros de ovinos positivos e um pool de soros negativos para LC. Na imunovarredura foram identificados quatro clones que reagiram fortemente aos soros. Os clones foram confirmados, após a realização da PCR e sequenciamento para comparação genômica de C. pseudotuberculosis no GenBank. Esses genes foram identificados, com identidade entre 99% e 100% e E-value de 0.0, como codificadores de proteínas de membrana. Proteínas desse tipo podem ser antigênicas, podendo favorecer o desenvolvimento de vacinas de subunidades ou de DNA contra LC, bem como o desenvolvimento de testes sorológicos para diagnóstico. O uso de imunovarredura de biblioteca de expressão gênica apresentou-se como uma técnica sensível e eficiente na identificação de prováveis genes imunodominantes. Um desses genes foi o fagA e por isso ele foi avaliado como imunógeno na forma de vacina de DNA, bem como na forma de subunidade recombinante. Camundongos foram imunizados com pcDNAfagA, pcDNAfagA+FAGAr-Montanide e FAGAr-Montanide e desafiados com uma cepa virulenta de C. pseudotuberculosis. O estado clínico e as alterações anatomopatológicas foram avaliadas após o desafio. A detecção de IgG específico no soro dos camundongos imunizados, bem como seus isotipos IgG1 e IgG2a, foram avaliadas por ELISA indireto. Os níveis de IFN-? e IL-10 foram determinados por ELISA de captura a partir dos sobrenadantes de culturas de esplenócitos, estimulados com FAGAr. As respostas imunes celular e humoral induzidas pelas formulações vacinais pcDNAfagA, pcDNAfagA+FAGAr-Montanide e FAGAr-Montanide, foram capazes de proteger camundongos após o desafio com C. pseudotuberculosis virulenta, resultando na sobrevivência de camundongos sem alterações clínicas e anatomopatológicas características de LC. Essas formulações podem ser promissoras contra a LC em ovinos e caprinos.  aLinfadenite caseosa