Data/hora: 21/06/2024 05:34:05

Biblioteca(s): | Embrapa Agroindústria Tropical.
Tipo da produção científica: | Orientação de Tese de Pós-Graduação
Data corrente: | 19/12/2018
Data da última atualização: | 30/01/2019
Autoria: | SOUSA, A. J. S.
Afiliação: | Antônio Juscelino Sudário Sousa, Universidade Federal do Ceará.
Título: | Uma quitinase termoestável de chromobacterium violaceum atcc 12472 expressa em escherichia coli e que inibe a germinação de conídios de dois fungos fitopatogênicos isolados do abacaxi ornamental.
Ano de publicação: | 2018
Fonte/Imprenta: | 2018
Páginas: | 113 p.
Idioma: | Português
Notas: | Tese (Doutorado em Bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza. Orientador: Thalles Barbosa Grangeiro.
Conteúdo: | Chromobacterium violaceum é uma &#946;-proteobactéria Gram-negativa, saprófita, anaeróbia facultativa e de vida livre. Essa bactéria habita vários ecossistemas nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, principalmente em amostras de água ou de solo úmido. Ela caracteriza-se também por possuir um versátil metabolismo energético, fazendo uso de inúmeras enzimas que possibilitam a utilização de variadas fontes de energia. No genoma da C. violaceum foram identificadas diversas ORFs (open reading frames), codificando proteínas supostamente responsáveis por mediar a interação de C. violaceum com os vários elementos presentes nos ambientes em que ela habita. Entre estas proteínas, estão várias quitinases. Quitinases são enzimas capazes de hidrolisar a quitina, que é um polissacarídeo composto por resíduos de N-acetil-&#946;-D-glucosamina unidos por ligações O-glicosídicas do tipo &#946;- (1,4). Neste trabalho, o objetivo foi expressar uma quitinase (CV1440) de C. violaceum ATCC 12472 em E. coli, purificar a proteína recombinante e caracterizá-la em relação a aspectos bioquímicos e biológicos. A sequência codificada pela ORF CV1440 foi amplificada por reação em cadeia da DNA polimerase (PCR) e adicionada ao cassete de expressão do plasmídeo pET303/CT-His. O plasmídeo recombinante foi clonado em E. coli TOP10F' e posteriormente introduzido em E. coli BL21(DE3) para expressão. A proteína recombinante foi secretada para o meio de cultura, via peptídeo sinal endógeno. A quitinase foi então purificada a partir do meio livre de células por precipitação com sulfato de amônio (95% de saturação), cromatografia de afinidade a quitina, seguida de uma cromatografia de afinidade a níquel imobilizado em matriz de Sepharose. Quando submetida a eletroforese em condições desnaturantes (SDS- PAGE), a proteína purificada apresentou uma única banda com massa molecular aparente de cerca de 46 kDa. A identidade dessa banda como correspondendo à quitinase CV1440 foi confirmada por espectromeria de massas. O rendimento do produto recombinante purificado foi de aproximadamente 3 mg por litro de cultura. A quitinase recombinante purificada apresentou atividade ótima em pH 5,0, e apresentou uma temperatura ótima de 60 oC, foi moderadamente estavel a variação de pH e elevadamente estavel a variações de temperatura, mantendo mais de 50% da atividade quitinolítica após incubação a 100 oC por 1 hora. A atividade da enzima foi afetada negativamente pelos íons Cu+2, Hg+2, La+3 e Fe+2 e pelos agentes químicos DTT, &#946;-mercaptoetanol, e SDS, porém não houve aumento de atividade na presença de outros íons, bem como, na presença do quelante EDTA, sugerindo que a enzima não possui cofator. A enzima conseguiu inibir a germinação de conídios dos fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum e F. proliferatum. Ensaios de microscopia de força atômica revelaram alterações mORFológicas pronunciadas na superfície de esporos incubados com CvChi47 quando comparados aos conídios não tratados com a enzima. Juntos, esses resultados indicam a possibilidade de utilização futura da quitinase codificada pela ORF CV1440 como uma potencial ferramenta no controle de fungos fitopatogênicos.
Palavras-Chave: | CV1440.
Thesagro: | Escherichia Coli; Fusarium Oxysporum.
Thesaurus Nal: | Atomic force microscopy; Chromobacterium violaceum; Fusarium proliferatum.
Categoria do assunto: | --
URL: | http://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/188981/1/Tese-Antonio-.pdf
Registro original: | Embrapa Agroindústria Tropical (CNPAT)
Exemplares: | CNPAT - (15818-1) - UPA - TS - DD - 2018.00015 -  - 2018.00015 - DIS