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Registro Completo |
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Biblioteca(s): |
Embrapa Suínos e Aves. |
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Data corrente: |
20/03/2019 |
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Data da última atualização: |
20/03/2019 |
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Tipo da produção científica: |
Orientação de Tese de Pós-Graduação |
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Autoria: |
SILVA, Z. da. |
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Afiliação: |
ZIGOMAR DA SILVA, UDESC. |
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Título: |
Transfecção de espermatozoides suínos por polifecção e eletroporação. |
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Ano de publicação: |
2018 |
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Fonte/Imprenta: |
2018. |
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Páginas: |
96 f. |
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Descrição Física: |
Dissertação (Pós-graduação em Ciência Animal) - Centro de Ciências Agroveterinárias, Universidade do Estado de Santa Catarina, Lages, SC. |
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Idioma: |
Português |
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Notas: |
Orientador: Mariana Groke Marques. |
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Conteúdo: |
Suínos transgênicos são criados para várias finalidades, podendo ser usados como biorreatores ou como modelos para estudos de doenças humanas e na pecuária. Estes podem ser obtidos por várias metodologias, porém, devido a sua simplicidade e baixo custo, a transgenia mediada por espermatozoide apresenta-se como uma metodologia bastante promissora. Visando aumentar a eficiência desta técnica, em outras espécies são usados métodos químicos, como a polifecção utilizando a polietilenoimina (PEI) e físicos, como a eletroporação, que possibilitam aos espermatozoides captarem maiores quantidades de DNA exógeno (eDNA), mas nenhum destes esta padronizado para suínos. O objetivo deste estudo foi otimizar protocolos para o uso da eletroporação e d a polifecção utilizando a polietilenoimina na transfecção de espermatozoides suínos e definir qual destes métodos é o mais eficiente. Para isso, utilizou-se doses inseminantes de 10 machos suínos de linhagens comerciais, que foram divididas em amostras de 2x106spz/mL. Para a padronização da eletroporação estas amostras foram testadas duas voltagens (500 ou 1000 volts) em um pulso único ou duplo, com duas durações de pulso (250 ou 500μs). Já para a padronização da PEI foram testadas quatro diferentes concentrações (0,5, 1, 2 ou 4) mg/mL de PEI, marcada com a sonda FITC, incubando-se durante 10 minutos, 2 e 4 horas. Os dois melhores protocolos para cada um dos métodos foram analisados por citometria de fluxo quanto a viabilidade celular, empregando-se as sondas FITC, PI, laranja de acridina e JC1, as quais, avaliam, respectivamente, a integridade de membrana, de acrossoma, de cromatina e potencial mitocondrial. O protocolo, de cada método, que apresentou melhor viabilidade celular foi utilizado na transfecção com o plasmídeo pmhyGENIE-5, sendo que para a eletroporação elegeu-se 500 volts, 500 μs e 2 pulsos e para a PEI o melhor protocolo foi 0,5mg/mL, com incubação de 10 minutos. Após, uma alíquota das amostras foi utilizada para avaliação da viabilidade celular, por citometria de fluxo e outra alíquota foi destinada a hibridização in situ fluorescente, para a detecção do plasmídeo nos espermatozoides. A FISH foi realizada utilizando duas sondas, ambas com 200 bases cada. Como teste, utilizouse uma sonda para o gene EGPF do plasmídeo, marcada com o fluoróforo Cyanine 5, e como controle da reação, uma sonda para o gene cromossômico suíno SRY, esta marcada com Cyanine 3. A avaliação das laminas da FISH foi realizada em microscópio de fluorescência (Axio Observer A1, Carl Zeiss), pela contagem de 100 espermatozoides por lamina e a observação do número de marcações para cada uma das sondas. O método de incubação, que foi utilizado como controle demonstrou uma taxa de transfecção de 17,80%±1,07. A eletroporação teve 36,70%±2,78 de eficiência, enquanto a taxa de transfecção da PEI foi de 76,8%±3,09, demonstrando que estes métodos foram mais eficientes que a incubação. A eletroporação, apesar da maior taxa de transfecção, este método causou grande taxa de lesão de acrossoma. A polifecção, da mesma forma, teve alta taxa de lesão de acrossoma, bem como de membrana citoplasmática. Devido a isso, é recomendável que os espermatozoides transfectados por estes métodos sejam utilizados em biotécnicas de fertilização, como a injeção intracitoplasmática de espermatozoide. MenosSuínos transgênicos são criados para várias finalidades, podendo ser usados como biorreatores ou como modelos para estudos de doenças humanas e na pecuária. Estes podem ser obtidos por várias metodologias, porém, devido a sua simplicidade e baixo custo, a transgenia mediada por espermatozoide apresenta-se como uma metodologia bastante promissora. Visando aumentar a eficiência desta técnica, em outras espécies são usados métodos químicos, como a polifecção utilizando a polietilenoimina (PEI) e físicos, como a eletroporação, que possibilitam aos espermatozoides captarem maiores quantidades de DNA exógeno (eDNA), mas nenhum destes esta padronizado para suínos. O objetivo deste estudo foi otimizar protocolos para o uso da eletroporação e d a polifecção utilizando a polietilenoimina na transfecção de espermatozoides suínos e definir qual destes métodos é o mais eficiente. Para isso, utilizou-se doses inseminantes de 10 machos suínos de linhagens comerciais, que foram divididas em amostras de 2x106spz/mL. Para a padronização da eletroporação estas amostras foram testadas duas voltagens (500 ou 1000 volts) em um pulso único ou duplo, com duas durações de pulso (250 ou 500μs). Já para a padronização da PEI foram testadas quatro diferentes concentrações (0,5, 1, 2 ou 4) mg/mL de PEI, marcada com a sonda FITC, incubando-se durante 10 minutos, 2 e 4 horas. Os dois melhores protocolos para cada um dos métodos foram analisados por citometria de fluxo quanto a viabilidade celular, em... Mostrar Tudo |
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Palavras-Chave: |
Eletroporação; Polietilenoimina. |
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Thesagro: |
Espermatozóide; Organismo Transgênico; Reprodução Animal; Suinocultura. |
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Categoria do assunto: |
-- |
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Registro original: |
Embrapa Suínos e Aves (CNPSA) |
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| 1. |  | ALVES, C. P.; SILVA, T. G. F. da; ARAÚJO JÚNIOR, G. do N.; SOUZA, L. S. B. de; JARDIM, A. M. da R. F.; ARAUJO, G. G. L. de; QUEIROZ, M. A. A.; SILVA, S. M. S. e; PINHEIRO, A. G.; SALVADOR, K. R. da S. Morphophysiological indicators, phenophase and cutting time in an irrigated forage cactus–sorghum intercropping system under strategies of agricultural resilience and agriculture biosaline. Irrigation and Drainage, June, 2024. On-line.| Tipo: Artigo em Periódico Indexado | Circulação/Nível: A - 4 |
| Biblioteca(s): Embrapa Semiárido. |
|    |
| 2. | | SILVA, G. I. N.; JARDIM, A. M. da R. F.; SOUZA, M. de S.; ARAÚJO JÚNIOR, G. do N.; MORAIS, J. E. F. de; SOUZA, L. S. B. de; SOUZA, C. A. A. de; ALVES, C. P.; ARAUJO, G. G. L. de; MONTENEGRO, A. A. de A.; LIMA, B. L. de C.; SILVA, T. G. F. da. Combined agricultural practices in millet and cactus: phyllochron, structural characteristics and relations with yield. Scientia Agrícola, v. 80, e20220046, 2023.| Tipo: Artigo em Periódico Indexado | Circulação/Nível: A - 2 |
| Biblioteca(s): Embrapa Semiárido. |
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| 3. | | ARAÚJO JÚNIOR, G. do N.; SILVA, T. G. F. da; SOUZA, L. S. B. de; SOUZA, M. de S.; ARAUJO, G. G. L. de; MOURA, M. S. B. de; SANTOS, J. P. A. de S.; JARDIM, A. M. da R. F.; ALVES, C. P.; ALVES, H. K. M. N. Productivity, bromatological composition and economic benefits of using irrigation in the forage cactus under regulated deficit irrigation in a semiarid environment. Bragantia, v. 80, jan. 2021.| Tipo: Artigo em Periódico Indexado | Circulação/Nível: B - 1 |
| Biblioteca(s): Embrapa Semiárido. |
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| 4. | | ARAÚJO JÚNIOR, G. do N.; SILVA, T. G. F. da; SOUZA, L. S. B. de; ARAUJO, G. G. L. de; MOURA, M. S. B. de; ALVES, C. P.; SALVADOR, K. R. da S.; SOUZA, C. A. A. de; MONTENEGRO, A. A. de A.; LIMA, M. J. da S. Phenophases, morphophysiological indices and cutting time in clones of the forage cacti under controlled water regimes in a semiarid environment. Journal of Arid Environments, v. 190, 104510, 2021.| Tipo: Artigo em Periódico Indexado | Circulação/Nível: A - 2 |
| Biblioteca(s): Embrapa Semiárido. |
|  |
| 5. | | ALVES, C. P.; JARDIM, A. M. da Ro F.; ARAÚJO JÚNIOR, C. do N.; SOUZA, L. S. B. de; ARAUJO, G. G. L. de; SOUZA, C. A. A. de; SALVADOR, K. R. da S.; LEITE, R. M. C.; PINHEIRO, A. G.; SILVA, T. G. F. da. How to enhance the agronomic performance of cactus-sorghum intercropped system: planting configurations, density and orientation. Industrial Crops and Products, v. 184, 115059, 2022.| Tipo: Artigo em Periódico Indexado | Circulação/Nível: A - 1 |
| Biblioteca(s): Embrapa Semiárido. |
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| 6. | | ALVES, H. K. M. N.; JARDIM, A. M. da R. F.; SOUZA, L. S. B. de; ARAÚJO JÚNIOR, G. do N.; ALVES, C. P.; ARAUJO, G. G. L. de; STEIDLE NETO, A. J.; SALVADOR, K. R. da S.; PINHEIRO, A. G.; SILVA, T. G. F. da. Integrated management of agronomic practices in the forage cactus: maximizing productivity, biological efficiency and economic profitability. Journal of the Professional Association for Cactus Development, v. 24, p. 307-329, 2022.| Tipo: Artigo em Periódico Indexado | Circulação/Nível: B - 3 |
| Biblioteca(s): Embrapa Semiárido. |
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