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Biblioteca(s): | Embrapa Agrobiologia.
Data corrente: | 16/04/2007
Data da última atualização: | 17/11/2015
Autoria: | GUEDES, H. V.
Título: | Anotação das vias metabólicas do nitrogênio em Gluconacetobacter diazotrophicus: obtenção e caracterização de mutantes.
Ano de publicação: | 2006
Fonte/Imprenta: | 2006. 75 f. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro de Ciências da Saúde, Rio de Janeiro, RJ.
Páginas: | 75 f.
Idioma: | Português
Notas: | Orientador: José Ivo Baldani

Conteúdo:

Dentre as bactérias endofiticas e fixadoras de nitrogênio mais estudados esta a espécie Gluconacetobacter diazotrophicus que tem sido considerada uma das mais importantes para a cultura de cana-de-açúcar, sendo encontrada em alto número, colonizando o interior de tecidos de raízes, colmos e folhas. Apesar de vários estudos já terem sido realizados sobre a fisiologia e processo de Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) da bactéria G. diazotrophicus, ainda 1130 foi possível fazer uma caracterização ampla de aspectos fisiológicos importantes para a associação. Neste trabalho buscou-se identificar, por homologia, as rotas bioquímicas do metabolismo de nitrogênio, em G. diazotrophicus estirpe PAL5. Os resultados sugerem a existência de vias alternativas para a assimilação da amônia tixada, alem da via principal pelas enzimas GS/GOGAT. Foram encontradas as enzimas putativas nitropropano dioxigenase e nitrilases, conhecidas por estarem envolvidas com a degradação de compostos nitrogenados sugerindo que esta bacteria seja capaz de utilizar nitroalcanos, nitrilas e nitrito como fonte de nitrogênio, alem da amônia e N2. Apesar desses indícios, o papel ecológica dessas enzimas em G. diazotrophicus não e conhecido.
Além disso, foram construídos mutantes aleatórios, utilizando urn transposon comercial, com o objetivo de identificar genes envolvidos com a FBN. Esses mutantes foram selecionados pelo método de enriquecimento com Ampicilina e caracterizados com relação a atividade da enzima nitrogenase e produção de Indol (AlA). Foi possível obter dezesseis (16) mutantes com atividade reduzida da nitrogenase e quatro (4) mutantes com alta produção de AlA. 0 mutante 28 apresentou baixa atividade da nitrogenase e alta produção de AlA comparado a estirpe selvagem (PAL5). 0 sequenciamento do mutante 29, que apresentou baixa atividade da nitrogenase e produção de AlA estatisticamente igual a P AL5, mostrou a inserção do transposon na ORF 56 (contig 431) que e homóloga a proteína osmo-sensora, envZ putativa, de G. oxidans. Essa família de proteínas esta estruturalmente relacionada a domineos A TP-ligantes, relacionados a sensores bacterianos e proteínas quimiotaticas como por exemplo histidina quinases, sistemas Ntr e proteínas reparadoras de DNA. Não esta claro como essa mutação influenciou a atividade da nitrogenase. A metodologia aplicada pode ter selecionado urn mutante de proteína osmo-protetora e assim a bacteria não conseguiu estabelecer um crescimento ótimo no meio de cultura semi-sólido. São necessários mais estudos para verificar 0 local de inserção do transposon nos demais mutantes, 0 mecanismo de regulação dos genes silenciados e avaliar, através de experimentos de inoculação, a contribuição para 0 crescimento de plantas de cana-de-açúcar. Da mesma forma, 0 sequenciamento completo do genoma em andamento, permitira urna visão mais ampla das rotas metabólicas do nitrogênio em G. diazotrophicus.

Among the already known endophytic nitrogen-fixing bacteria, Gluconacetobacter diazotrophicus species has been considered one of most important ones colonizing sugar cane and being found in high numbers colonizing the interior of roots, stems and leaves. Although some physiological studies have already been carried on G. diazotrophicus, there are still many important aspects of the bacteria that needs to be clarified. In this work, we try to identify, through the homology, the route of the nitrogen metabolism in G. diazotrophicus strain PAL5. The results suggested the existence of alternative ways for the assimilation of fixed ammonia, beyond the main pathway for the enzymes GS/GOGAT. The putative enzymes nitropropane dioxygenase and nitrilases, known to be involved with the degradation of nitrogen compounds have been detected, suggesting that this bacterium is capable to use nitroalkanes, nitrilas and nitrite as nitrogen source, besides the ammonia and N2. It is not known the ecological role of these enzymes in G. diazotrophicus. Moreover, it was constructed aleatory mutants, using a commercial transposon kit, with the objective to identify genes involved with the BFN. These mutants were selected by the method of enrichment with Ampicillin and characterized with regard to the nitrogenase activity and the production of Indolic substances (IAA). It was possible to select sixteen (16) mutants with reduced nitrogenase activity and four (4) mutants with high production of IAA. Mutant number 28 presented a low nitrogenase activity and high production of IAA as compared to the the wild-type strain (PAL5). The sequencing of the transposon insertion in the mutant 29 - low nitrogenase activity but similar IAA production to P AL5, showed that the insertion of transposon was in the ORF 56 (contig 431) that is homologous to the osmo sensory protein, envZ putative, present in G. oxidans. This protein family is structurally related to the A TP-binding domains related to the bacterial sensors and quimiotatic proteins like histidin quinases, Ntr systems and DNA repair proteins. Is not clearly how this mutation influenced the nitrogenase activity. The applied methodology selected a osmo-protector protein mutant and therefore the bacterium did not establish an excellent growth condition in the semi-solid culture medium. More studies are necessary to verify the sites of the transposon insertion in the others mutants as well as the mechanism of regulation of the silenced genes and the evaluation of the effects on the growth of sugar cane plants. In the same way, the complete genome sequencing will allow to obtain a complete view of the nitrogen metabolic routes in G. diazotrophicus.

Palavras-Chave: | Bioinformática; FBN; Fixação biológica de nitrogênio; Metabolismo do nitrogênio.
Categoria do assunto: | --
Registro original: | Embrapa Agrobiologia (CNPAB)
Exemplares: | CNPAB - (34061-1) - ADD - TS - -- - 2007.00011 -  - 2007.00011 - DIS