| |
|
|
 | Acesso ao texto completo restrito à biblioteca da Embrapa Suínos e Aves. Para informações adicionais entre em contato com cnpsa.biblioteca@embrapa.br. |
|
Registro Completo |
|
Biblioteca(s): |
Embrapa Suínos e Aves. |
|
Data corrente: |
20/03/2019 |
|
Data da última atualização: |
20/03/2019 |
|
Tipo da produção científica: |
Orientação de Tese de Pós-Graduação |
|
Autoria: |
SILVA, Z. da. |
|
Afiliação: |
ZIGOMAR DA SILVA, UDESC. |
|
Título: |
Transfecção de espermatozoides suínos por polifecção e eletroporação. |
|
Ano de publicação: |
2018 |
|
Fonte/Imprenta: |
2018. |
|
Páginas: |
96 f. |
|
Descrição Física: |
Dissertação (Pós-graduação em Ciência Animal) - Centro de Ciências Agroveterinárias, Universidade do Estado de Santa Catarina, Lages, SC. |
|
Idioma: |
Português |
|
Notas: |
Orientador: Mariana Groke Marques. |
|
Conteúdo: |
Suínos transgênicos são criados para várias finalidades, podendo ser usados como biorreatores ou como modelos para estudos de doenças humanas e na pecuária. Estes podem ser obtidos por várias metodologias, porém, devido a sua simplicidade e baixo custo, a transgenia mediada por espermatozoide apresenta-se como uma metodologia bastante promissora. Visando aumentar a eficiência desta técnica, em outras espécies são usados métodos químicos, como a polifecção utilizando a polietilenoimina (PEI) e físicos, como a eletroporação, que possibilitam aos espermatozoides captarem maiores quantidades de DNA exógeno (eDNA), mas nenhum destes esta padronizado para suínos. O objetivo deste estudo foi otimizar protocolos para o uso da eletroporação e d a polifecção utilizando a polietilenoimina na transfecção de espermatozoides suínos e definir qual destes métodos é o mais eficiente. Para isso, utilizou-se doses inseminantes de 10 machos suínos de linhagens comerciais, que foram divididas em amostras de 2x106spz/mL. Para a padronização da eletroporação estas amostras foram testadas duas voltagens (500 ou 1000 volts) em um pulso único ou duplo, com duas durações de pulso (250 ou 500μs). Já para a padronização da PEI foram testadas quatro diferentes concentrações (0,5, 1, 2 ou 4) mg/mL de PEI, marcada com a sonda FITC, incubando-se durante 10 minutos, 2 e 4 horas. Os dois melhores protocolos para cada um dos métodos foram analisados por citometria de fluxo quanto a viabilidade celular, empregando-se as sondas FITC, PI, laranja de acridina e JC1, as quais, avaliam, respectivamente, a integridade de membrana, de acrossoma, de cromatina e potencial mitocondrial. O protocolo, de cada método, que apresentou melhor viabilidade celular foi utilizado na transfecção com o plasmídeo pmhyGENIE-5, sendo que para a eletroporação elegeu-se 500 volts, 500 μs e 2 pulsos e para a PEI o melhor protocolo foi 0,5mg/mL, com incubação de 10 minutos. Após, uma alíquota das amostras foi utilizada para avaliação da viabilidade celular, por citometria de fluxo e outra alíquota foi destinada a hibridização in situ fluorescente, para a detecção do plasmídeo nos espermatozoides. A FISH foi realizada utilizando duas sondas, ambas com 200 bases cada. Como teste, utilizouse uma sonda para o gene EGPF do plasmídeo, marcada com o fluoróforo Cyanine 5, e como controle da reação, uma sonda para o gene cromossômico suíno SRY, esta marcada com Cyanine 3. A avaliação das laminas da FISH foi realizada em microscópio de fluorescência (Axio Observer A1, Carl Zeiss), pela contagem de 100 espermatozoides por lamina e a observação do número de marcações para cada uma das sondas. O método de incubação, que foi utilizado como controle demonstrou uma taxa de transfecção de 17,80%±1,07. A eletroporação teve 36,70%±2,78 de eficiência, enquanto a taxa de transfecção da PEI foi de 76,8%±3,09, demonstrando que estes métodos foram mais eficientes que a incubação. A eletroporação, apesar da maior taxa de transfecção, este método causou grande taxa de lesão de acrossoma. A polifecção, da mesma forma, teve alta taxa de lesão de acrossoma, bem como de membrana citoplasmática. Devido a isso, é recomendável que os espermatozoides transfectados por estes métodos sejam utilizados em biotécnicas de fertilização, como a injeção intracitoplasmática de espermatozoide. MenosSuínos transgênicos são criados para várias finalidades, podendo ser usados como biorreatores ou como modelos para estudos de doenças humanas e na pecuária. Estes podem ser obtidos por várias metodologias, porém, devido a sua simplicidade e baixo custo, a transgenia mediada por espermatozoide apresenta-se como uma metodologia bastante promissora. Visando aumentar a eficiência desta técnica, em outras espécies são usados métodos químicos, como a polifecção utilizando a polietilenoimina (PEI) e físicos, como a eletroporação, que possibilitam aos espermatozoides captarem maiores quantidades de DNA exógeno (eDNA), mas nenhum destes esta padronizado para suínos. O objetivo deste estudo foi otimizar protocolos para o uso da eletroporação e d a polifecção utilizando a polietilenoimina na transfecção de espermatozoides suínos e definir qual destes métodos é o mais eficiente. Para isso, utilizou-se doses inseminantes de 10 machos suínos de linhagens comerciais, que foram divididas em amostras de 2x106spz/mL. Para a padronização da eletroporação estas amostras foram testadas duas voltagens (500 ou 1000 volts) em um pulso único ou duplo, com duas durações de pulso (250 ou 500μs). Já para a padronização da PEI foram testadas quatro diferentes concentrações (0,5, 1, 2 ou 4) mg/mL de PEI, marcada com a sonda FITC, incubando-se durante 10 minutos, 2 e 4 horas. Os dois melhores protocolos para cada um dos métodos foram analisados por citometria de fluxo quanto a viabilidade celular, em... Mostrar Tudo |
|
Palavras-Chave: |
Eletroporação; Polietilenoimina. |
|
Thesagro: |
Espermatozóide; Organismo Transgênico; Reprodução Animal; Suinocultura. |
|
Categoria do assunto: |
-- |
|
Marc: |
LEADER 04200nam a2200205 a 4500
001 2107284
005 2019-03-20
008 2018 bl uuuu m 00u1 u #d
100 1 $aSILVA, Z. da
245 $aTransfecção de espermatozoides suínos por polifecção e eletroporação.$h[electronic resource]
260 $a2018.$c2018
300 $a96 f.$cDissertação (Pós-graduação em Ciência Animal) - Centro de Ciências Agroveterinárias, Universidade do Estado de Santa Catarina, Lages, SC.
500 $aOrientador: Mariana Groke Marques.
520 $aSuínos transgênicos são criados para várias finalidades, podendo ser usados como biorreatores ou como modelos para estudos de doenças humanas e na pecuária. Estes podem ser obtidos por várias metodologias, porém, devido a sua simplicidade e baixo custo, a transgenia mediada por espermatozoide apresenta-se como uma metodologia bastante promissora. Visando aumentar a eficiência desta técnica, em outras espécies são usados métodos químicos, como a polifecção utilizando a polietilenoimina (PEI) e físicos, como a eletroporação, que possibilitam aos espermatozoides captarem maiores quantidades de DNA exógeno (eDNA), mas nenhum destes esta padronizado para suínos. O objetivo deste estudo foi otimizar protocolos para o uso da eletroporação e d a polifecção utilizando a polietilenoimina na transfecção de espermatozoides suínos e definir qual destes métodos é o mais eficiente. Para isso, utilizou-se doses inseminantes de 10 machos suínos de linhagens comerciais, que foram divididas em amostras de 2x106spz/mL. Para a padronização da eletroporação estas amostras foram testadas duas voltagens (500 ou 1000 volts) em um pulso único ou duplo, com duas durações de pulso (250 ou 500μs). Já para a padronização da PEI foram testadas quatro diferentes concentrações (0,5, 1, 2 ou 4) mg/mL de PEI, marcada com a sonda FITC, incubando-se durante 10 minutos, 2 e 4 horas. Os dois melhores protocolos para cada um dos métodos foram analisados por citometria de fluxo quanto a viabilidade celular, empregando-se as sondas FITC, PI, laranja de acridina e JC1, as quais, avaliam, respectivamente, a integridade de membrana, de acrossoma, de cromatina e potencial mitocondrial. O protocolo, de cada método, que apresentou melhor viabilidade celular foi utilizado na transfecção com o plasmídeo pmhyGENIE-5, sendo que para a eletroporação elegeu-se 500 volts, 500 μs e 2 pulsos e para a PEI o melhor protocolo foi 0,5mg/mL, com incubação de 10 minutos. Após, uma alíquota das amostras foi utilizada para avaliação da viabilidade celular, por citometria de fluxo e outra alíquota foi destinada a hibridização in situ fluorescente, para a detecção do plasmídeo nos espermatozoides. A FISH foi realizada utilizando duas sondas, ambas com 200 bases cada. Como teste, utilizouse uma sonda para o gene EGPF do plasmídeo, marcada com o fluoróforo Cyanine 5, e como controle da reação, uma sonda para o gene cromossômico suíno SRY, esta marcada com Cyanine 3. A avaliação das laminas da FISH foi realizada em microscópio de fluorescência (Axio Observer A1, Carl Zeiss), pela contagem de 100 espermatozoides por lamina e a observação do número de marcações para cada uma das sondas. O método de incubação, que foi utilizado como controle demonstrou uma taxa de transfecção de 17,80%±1,07. A eletroporação teve 36,70%±2,78 de eficiência, enquanto a taxa de transfecção da PEI foi de 76,8%±3,09, demonstrando que estes métodos foram mais eficientes que a incubação. A eletroporação, apesar da maior taxa de transfecção, este método causou grande taxa de lesão de acrossoma. A polifecção, da mesma forma, teve alta taxa de lesão de acrossoma, bem como de membrana citoplasmática. Devido a isso, é recomendável que os espermatozoides transfectados por estes métodos sejam utilizados em biotécnicas de fertilização, como a injeção intracitoplasmática de espermatozoide.
650 $aEspermatozóide
650 $aOrganismo Transgênico
650 $aReprodução Animal
650 $aSuinocultura
653 $aEletroporação
653 $aPolietilenoimina
Download
Esconder MarcMostrar Marc Completo |
|
Registro original: |
Embrapa Suínos e Aves (CNPSA) |
|
|
Biblioteca |
ID |
Origem |
Tipo/Formato |
Classificação |
Cutter |
Registro |
Volume |
Status |
URL |
Voltar
|
|
|
| Registros recuperados : 2 | |
| 1. |  | SCALEA, M. J. Plantio direto em regiões do cerrado. In: SIMPOSIO SOBRE O CERRADO, 8.; INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON TROPICAL SAVANNAS, 1., 1996, Brasilia, DF. Biodiversidade e producao sustentavel de alimentos e fibras nos Cerrados: anais... Planaltina: EMBRAPA-CPAC, 1996. p.102-103.| Biblioteca(s): Embrapa Cerrados. |
|    |
| Registros recuperados : 2 | |
|
| Nenhum registro encontrado para a expressão de busca informada. |
|
|
