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Registro Completo |
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Biblioteca(s): |
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. |
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Data corrente: |
09/09/2025 |
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Data da última atualização: |
09/09/2025 |
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Tipo da produção científica: |
Resumo em Anais de Congresso |
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Autoria: |
FARIA, D. A. de. |
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Afiliação: |
DANIELLE ASSIS DE FARIA, CENARGEN. |
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Título: |
Marcadores moleculares de DNA. |
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Ano de publicação: |
2007 |
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Fonte/Imprenta: |
In: ENCONTRO NACIONAL DE MÉTODOS DE LABORATÓRIOS, 12., 2007, Rio Branco, AC. Metodologias, ensaios e tecnologias para a agricultura tropical do futuro: anais. Rio Branco, AC: Embrapa Acre, 2007. |
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Idioma: |
Português |
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Conteúdo: |
Estudos que envolvem o uso de marcadores moleculares são, atualmente, uma realidade no Brasil e são usados em todos os principais grupos de organismos (vegetais, animais e microrganismos). O sucesso do uso destas metodologias esta intimamente relacionada a capacidade de extrair o DNA de tecidos/indivíduos em quantidade e qualidade adequadas de forma rápida e eficiente. Uma das considerações mais importantes em qualquer procedimento de extração de DNA é a maneira utilizada para coletar e preservar o tecido coletado. Especificamente em plantas, embora o DNA tenha sido isolado com sucesso de amostras herbarizadas ou mesmo fósseis, a quantidade e qualidade do DNA em geral são afetadas significativamente pela condição do tecido antes da extração. Isto é particularmente importante para espécies que produzem grandes quantidades de compostos secundários que, em geral, interferem em uma extração bem sucedida de DNA. Via de regra sugerese utilizar material o mais fresco possível. Desta forma, tecidos novos colidos na fase ativa de crescimento das plantas frequentemente fornecem os melhores resultados. O material fresco, após sua coleta, pode ser mantido em gelo ou geladeira. Em caso da necessidade de armazenamento em longo prazo sugere-se a estocagem do material - 20°C por algumas semanas ou a -80°C indefinidamente. Vários procedimentos de extração de DNA de tecidos vegetais têm sido descritos na literatura. Os protocolos se caracterizam basicamente por utilizar o detergente CTAB (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide) no tampão de extração e são, portanto, comumente denominados “protocolos CTAB”. Algumas poucas variações são utilizadas nesses protocolos em razão do tecido e/ou espécie a ser utilizada. Este protocolo funciona com sucesso em espécies tais como Eucalyptus, Citrus, Pinus, Brassica, milho, arroz, dendê e espécies arbóreas e leguminosas nativas. Uma das grandes vantagens deste método é que não exige preparação prévia do tecido e é adaptável a vários tipos de tecido, incluindo raízes, folhas, sementes, embriões, câmbio, endosperma, pólen e culturas de células em suspensão. Uma vez obtido o DNA é necessário realizar sua devida quantificação de maneira a otimizar seu uso. Várias também são as técnicas usadas para quantificação do DNA, algumas dependendo do emprego de equipamentos onerosos, como espectrofotômetro, enquanto outras, menos precisas, são simples e baratas. A técnica de quantificação comparativa em géis corados com brometo de etídeo é a mais barata e amplamente utilizada para quantificação de DNA em estudos de marcadores moleculares. Após a quantificação e realização das devidas diluições o DNA está, em teoria, apto a ser submetido às metodologias baseadas na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para obtenção e análise de seus polimorfismos. A amplificação de fragmentos polimórficos pela PCR usando primers de seqüência arbitrária (RAPD) é uma tecnologia estabelecida e utilizada para gerar informação sobre variabilidade ao nível de DNA e possui várias aplicações tais como: mapeamento genético, genética de populações, taxonomia molecular, “fingerprinting” de genótipos e seleção assistida por marcadores. É uma técnica universal, devido à utilização de primers arbitrários, ou seja, pode ser utilizada em qualquer espécie sem conhecimento prévio do genoma desta espécie. Além disso, possui outras vantagens como: rapidez e simplicidade na obtenção dos dados, baixo custo e fácil interpretação dos dados. Seqüências simples repetidas (SSR – Simple Sequence Repeats), mais tarde denominadas microssatélites consistem de pequenas seqüências com 1 a 6 nucleotídeos de comprimento, repetidas em tandem. Essas seqüências estão distribuídas ao acaso e em grande número nos genomas de eucariotos. Essas regiões são amplificadas por meio de PCR. Entre as vantagens desses marcadores está a sua natureza codominante, o multialelismo e a sua distribuição por todo o genoma. Entre as limitações que podem ser citadas em relação a estes marcadores é a necessidade de um conhecimento prévio do genoma ou o trabalho extensivo necessário para o desenvolvimento dos marcadores para a espécie de interesse, além da necessidade de equipamentos e sistemas mais complexos para detecção e obtenção dos dados. O objetivo deste mini-curso é demonstrar, na prática, as etapas de extração de DNA a partir de tecidos vegetais bem como a amplificação e detecção de marcadores moleculares RAPD e SSR na espécie Hevea brasiliensis (nome vulgar: seringueira). MenosEstudos que envolvem o uso de marcadores moleculares são, atualmente, uma realidade no Brasil e são usados em todos os principais grupos de organismos (vegetais, animais e microrganismos). O sucesso do uso destas metodologias esta intimamente relacionada a capacidade de extrair o DNA de tecidos/indivíduos em quantidade e qualidade adequadas de forma rápida e eficiente. Uma das considerações mais importantes em qualquer procedimento de extração de DNA é a maneira utilizada para coletar e preservar o tecido coletado. Especificamente em plantas, embora o DNA tenha sido isolado com sucesso de amostras herbarizadas ou mesmo fósseis, a quantidade e qualidade do DNA em geral são afetadas significativamente pela condição do tecido antes da extração. Isto é particularmente importante para espécies que produzem grandes quantidades de compostos secundários que, em geral, interferem em uma extração bem sucedida de DNA. Via de regra sugerese utilizar material o mais fresco possível. Desta forma, tecidos novos colidos na fase ativa de crescimento das plantas frequentemente fornecem os melhores resultados. O material fresco, após sua coleta, pode ser mantido em gelo ou geladeira. Em caso da necessidade de armazenamento em longo prazo sugere-se a estocagem do material - 20°C por algumas semanas ou a -80°C indefinidamente. Vários procedimentos de extração de DNA de tecidos vegetais têm sido descritos na literatura. Os protocolos se caracterizam basicamente por utilizar o detergente CTAB (cat... Mostrar Tudo |
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Thesagro: |
DNA; Hevea Brasiliensis; Madeira; Seringueira. |
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Categoria do assunto: |
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520 $aEstudos que envolvem o uso de marcadores moleculares são, atualmente, uma realidade no Brasil e são usados em todos os principais grupos de organismos (vegetais, animais e microrganismos). O sucesso do uso destas metodologias esta intimamente relacionada a capacidade de extrair o DNA de tecidos/indivíduos em quantidade e qualidade adequadas de forma rápida e eficiente. Uma das considerações mais importantes em qualquer procedimento de extração de DNA é a maneira utilizada para coletar e preservar o tecido coletado. Especificamente em plantas, embora o DNA tenha sido isolado com sucesso de amostras herbarizadas ou mesmo fósseis, a quantidade e qualidade do DNA em geral são afetadas significativamente pela condição do tecido antes da extração. Isto é particularmente importante para espécies que produzem grandes quantidades de compostos secundários que, em geral, interferem em uma extração bem sucedida de DNA. Via de regra sugerese utilizar material o mais fresco possível. Desta forma, tecidos novos colidos na fase ativa de crescimento das plantas frequentemente fornecem os melhores resultados. O material fresco, após sua coleta, pode ser mantido em gelo ou geladeira. Em caso da necessidade de armazenamento em longo prazo sugere-se a estocagem do material - 20°C por algumas semanas ou a -80°C indefinidamente. Vários procedimentos de extração de DNA de tecidos vegetais têm sido descritos na literatura. Os protocolos se caracterizam basicamente por utilizar o detergente CTAB (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide) no tampão de extração e são, portanto, comumente denominados “protocolos CTAB”. Algumas poucas variações são utilizadas nesses protocolos em razão do tecido e/ou espécie a ser utilizada. Este protocolo funciona com sucesso em espécies tais como Eucalyptus, Citrus, Pinus, Brassica, milho, arroz, dendê e espécies arbóreas e leguminosas nativas. Uma das grandes vantagens deste método é que não exige preparação prévia do tecido e é adaptável a vários tipos de tecido, incluindo raízes, folhas, sementes, embriões, câmbio, endosperma, pólen e culturas de células em suspensão. Uma vez obtido o DNA é necessário realizar sua devida quantificação de maneira a otimizar seu uso. Várias também são as técnicas usadas para quantificação do DNA, algumas dependendo do emprego de equipamentos onerosos, como espectrofotômetro, enquanto outras, menos precisas, são simples e baratas. A técnica de quantificação comparativa em géis corados com brometo de etídeo é a mais barata e amplamente utilizada para quantificação de DNA em estudos de marcadores moleculares. Após a quantificação e realização das devidas diluições o DNA está, em teoria, apto a ser submetido às metodologias baseadas na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para obtenção e análise de seus polimorfismos. A amplificação de fragmentos polimórficos pela PCR usando primers de seqüência arbitrária (RAPD) é uma tecnologia estabelecida e utilizada para gerar informação sobre variabilidade ao nível de DNA e possui várias aplicações tais como: mapeamento genético, genética de populações, taxonomia molecular, “fingerprinting” de genótipos e seleção assistida por marcadores. É uma técnica universal, devido à utilização de primers arbitrários, ou seja, pode ser utilizada em qualquer espécie sem conhecimento prévio do genoma desta espécie. Além disso, possui outras vantagens como: rapidez e simplicidade na obtenção dos dados, baixo custo e fácil interpretação dos dados. Seqüências simples repetidas (SSR – Simple Sequence Repeats), mais tarde denominadas microssatélites consistem de pequenas seqüências com 1 a 6 nucleotídeos de comprimento, repetidas em tandem. Essas seqüências estão distribuídas ao acaso e em grande número nos genomas de eucariotos. Essas regiões são amplificadas por meio de PCR. Entre as vantagens desses marcadores está a sua natureza codominante, o multialelismo e a sua distribuição por todo o genoma. Entre as limitações que podem ser citadas em relação a estes marcadores é a necessidade de um conhecimento prévio do genoma ou o trabalho extensivo necessário para o desenvolvimento dos marcadores para a espécie de interesse, além da necessidade de equipamentos e sistemas mais complexos para detecção e obtenção dos dados. O objetivo deste mini-curso é demonstrar, na prática, as etapas de extração de DNA a partir de tecidos vegetais bem como a amplificação e detecção de marcadores moleculares RAPD e SSR na espécie Hevea brasiliensis (nome vulgar: seringueira).
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