04163nam a2200217 a 450000100080000000500110000800800410001910000210006024501030008126000160018430000110020050001680021152034130037965000220379265300260381465300290384065300200386965300230388965300140391265300190392611847232005-06-06       2003    bl uuuu  m   00u1 u    #d1 aBARROS, L. M. G.  aEstudos moleculares da proteina Rol A de Agrobacterium rhizogenes em plantas de Nicotiana tabacum.  a2003.c2003  a124 f.  aTese (Doutorado em Biologia Molecular) - Instituto de Ciencias Biológicas, Universidade de Brasília, Brasília. Orientador: Mauro Carneiro e Rosane H. C. Curtis.  aO gene rolA é originário da Agrobacterium rhizogenes, uma bactéria baciliforme Gram-negativa, patógeno natural de uma variedade de plantas dicotiledôneas. Este gene está localizado na região do T-DNA do plasmídeo Ri, proxímo aos genes rolB, rolC e rolD e, juntos, atuam sinergisticamente no sentido de estabelecer a doença conhecida como síndrome de raiz em cabeleira. O gene rolA quando expresso em plantas induz uma série de anomalias morfológicas e fisiológicas tais como baixo porte, enrugamento foliar, atraso na floração e senescência, diminuição das concentrações de giberelina e de poliaminas, entre outros. Embora sua função não esteja determinada, existem na literatura evidências de localização subcelular da proteína RolA em núcleo e em membrana. De fato, análises in silico revelaram na proteína RolA a existência de motivos putativos de integração em membrana com sinal de ancoramento do tipo âncora reversa e sinal de localização nuclear (NLS), localizados nos primeiros 37 resíduos de aminoácidos do seu N-terminal. Neste trabalho foram feitas fusões traducionais dos motivos transmembrânico e NLS putativos com a enzima repórter b-glucuronidase (Gus), bem como deleções seqüenciais nestes motivos, de forma a inativar suas funções putativas. De maneira similar, a região C-terminal contígua aos motivos identificados e a proteína RolA completa foram também fusionados, independentemente, com a proteína Gus. As fusões gênicas resultantes sob o controle do promotor 35SCaMV foram introduzidas em plantas de Nicotiana tabacum.  Análises das plantas transformadas demonstraram que a proteína quimérica RolA(100)::Gus, na qual a RolA está completa, é bifuncional, apresentando atividade enzimática Gus e sendo também capaz de induzir as alterações morfológicas características de plantas rolA. No caso das deleções da RolA foi observado que nem o N-terminal ou o C-terminal da proteína são capazes de induzir o fenótipo rolA nas plantas de fumo, sugerindo que a proteína completa é necessária para induzir as alterações fenotípicas observadas. Ensaios citoquímicos e imunocitoquímicos para localização subcelular sugerem a presença da proteína RolA::Gus nos plastídios, não tendo sido observado no núcleo ou em membrana. Análises in silico, utilizando programas desenvolvidos para identificar sinal de endereçamento em proteínas desconhecidas, apontou mitocôndria, núcleo e cloroplastos, como os prováveis sítios subcelulares de localização da RolA. Surpreendentemente, a atividade específica da proteína de fusão RolA(100)::Gus é até 50 vezes maior que a atividade específica da Gus nativa enquanto que nas deleções onde apenas o N-terminal da RolA, ou apenas seu C-terminal estão fusionados a Gus o aumento da atividade específica é em torno de 10 vezes. Demonstramos que o aumento da atividade específica da proteína de fusão RolA(100)::Gus está relacionado com a acumulação da mesma, não sendo observado mudanças significantes na quantidade do mRNA, nem na Km, nem na termoestabilidade. Ainda não conhecemos as bases moleculares para este grande acúmulo da proteína de fusão, uma das possibilidades seria de que a proteína RolA(100)::Gus esteja protegida de alguma via proteolítica celular em decorrência da sua própria função biológica e/ou localização subcelular.  aNicotiana Tabacum  aAcúmulo de proteína  aAgrobacterium rhizogenes  ab-glucuronidase  aFusão traducional  aGene rolA  aProteina Rol A