03465nam a2200193 a 450000100080000000500110000800800410001910000200006024501220008026000160020250002390021852026960045765000160315365300220316965300360319165300110322765300110323865300220324921328002022-12-16       2021    bl uuuu  m   00u1 u    #d1 aSOUZA, J. C. de  aRedução do teor de ácido fítico em sementes de soja mediado por CRISPR e RNA interferente.h[electronic resource]  a2021.c2021  aTese (Doutorado em Biologia molecular)- Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Brasília, DF. Orientador: Francisco José Lima Aragão; coorientador: Giovanni Rodrigues, Vianna Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.  aA maior parte do fósforo encontrado nas sementes de soja está acumulada na forma de ácido fítico, representando mais de 85% do fósforo total. Sua biossíntese ocorre através da via do inositol-fosfato. O ácido fítico está envolvido em várias funções regulatórias na planta. No entanto, quando está molécula está na forma de sal, fitato, é considerado um fator antinutricional, pois limita a disponibilidade de alguns nutrientes essenciais, diminuindo assim o valor nutricional das sementes. Além disso, o ácido fítico não é digerível pelos monogástricos, sendo amplamente excretado em vez de absorvido, levando ao acúmulo de fósforo nos solos onde é lançado, o que acaba por causar também poluição das águas. Portanto, a geração de uma linhagem de soja com reduzido teor de ácido fítico é uma grande demanda do setor produtivo. Assim o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma linhagem de soja com reduzido teor de ácido fítico, por meio da engenharia genética. Para isso, duas metodologias foram utilizadas, CRISPR e RNA interferente. Inicialmente duas configurações do sistema CRISPR foram avaliadas por hairy-root. (1) Um cassete simplificado, onde tanto a Cas9 quanto os RNA guias (sgRNA) são controlados por um mesmo promotor (STU), e (2) um cassete tradicional, mais comumente utilizado, onde a Cas9 está sob a regulação de um promotor e cada sgRNA por outro promotor (TCTU). O sistema STU aqui utilizado, permite uma redução de mais de 1.000pb no tamanho dos vetores de transformação. Foram escolhidos dois genes que atuam ao final da via de biossíntese do ácido fítico, GmIPK1 e GmIPK2. Os alvos foram escolhidos e os sgRNAs foram sintetizados e clonados nos vetores apropriados para edição em raízes de soja (sistema hairy-root- Agrobacterium rhizogenes). Os resultados indicaram que o sistema tradicional apresentou-se mais eficiente em gerar edições no genoma das raízes, embora os dois sistemas tenham demonstrado funcionalidade. O cassete TCTU foi então escolhido para gerar os transformantes definitivos de soja via sistema biobalístico de transformação. Plantas com edição em ambos os genes (GmIPK1 e GmIPK2) foram geradas individualmente, e o conteúdo de ácido fítico e fósforo livre presente nas sementes foram avaliados. Também foram geradas plantas de soja transformadas utilizando a técnica de RNA interferente para redução da expressão do gene GmIPK2. Análises da quantidade de ácido fítico e fósforo livre também foram realizados. A utilização de ambas as metodologias (CRISPR e RNAi), foram eficazes para gerar plantas de soja com redução no conteúdo de ácido fítico em sementes.  aGlycine Max  aEdição de genes  aEngenharia genética de plantas  aGmIPK1  aGmIPK2  aSoja transgênica