04200nam a2200205 a 450000100080000000500110000800800410001910000170006024501040007726000160018130001570019750000390035452034720039365000200386565000270388565000240391265000170393665300200395365300210397321072842019-03-20       2018    bl uuuu  m   00u1 u    #d1 aSILVA, Z. da  aTransfecção de espermatozoides suínos por polifecção e eletroporação.h[electronic resource]  a2018.c2018  a96 f.cDissertação (Pós-graduação em Ciência Animal) - Centro de Ciências Agroveterinárias, Universidade do Estado de Santa Catarina, Lages, SC.  aOrientador: Mariana Groke Marques.  aSuínos transgênicos são criados para várias finalidades, podendo ser usados como biorreatores ou como modelos para estudos de doenças humanas e na pecuária. Estes podem ser obtidos por várias metodologias, porém, devido a sua simplicidade e baixo custo, a transgenia mediada por espermatozoide apresenta-se como uma metodologia bastante promissora. Visando aumentar a eficiência desta técnica, em outras espécies são usados métodos químicos, como a polifecção utilizando a polietilenoimina (PEI) e físicos, como a eletroporação, que possibilitam aos espermatozoides captarem maiores quantidades de DNA exógeno (eDNA), mas nenhum destes esta padronizado para suínos. O objetivo deste estudo foi otimizar protocolos para o uso da eletroporação e d a polifecção utilizando a polietilenoimina na transfecção de espermatozoides suínos e definir qual destes métodos é o mais eficiente. Para isso, utilizou-se doses inseminantes de 10 machos suínos de linhagens comerciais, que foram divididas em amostras de 2x106spz/mL. Para a padronização da eletroporação estas amostras foram testadas duas voltagens (500 ou 1000 volts) em um pulso único ou duplo, com duas durações de pulso (250 ou 500μs). Já para a padronização da PEI foram testadas quatro diferentes concentrações (0,5, 1, 2 ou 4) mg/mL de PEI, marcada com a sonda FITC, incubando-se durante 10 minutos, 2 e 4 horas. Os dois melhores protocolos para cada um dos métodos foram analisados por citometria de fluxo quanto a viabilidade celular, empregando-se as sondas FITC, PI, laranja de acridina e JC1, as quais, avaliam, respectivamente, a integridade de membrana, de acrossoma, de cromatina e potencial mitocondrial. O protocolo, de cada método, que apresentou melhor viabilidade celular foi utilizado na transfecção com o plasmídeo pmhyGENIE-5, sendo que para a eletroporação elegeu-se 500 volts, 500 μs e 2 pulsos e para a PEI o melhor protocolo foi 0,5mg/mL, com incubação de 10 minutos. Após, uma alíquota das amostras foi utilizada para avaliação da viabilidade celular, por citometria de fluxo e outra alíquota foi destinada a hibridização in situ fluorescente, para a detecção do plasmídeo nos espermatozoides. A FISH foi realizada utilizando duas sondas, ambas com 200 bases cada. Como teste, utilizouse uma sonda para o gene EGPF do plasmídeo, marcada com o fluoróforo Cyanine 5, e como controle da reação, uma sonda para o gene cromossômico suíno SRY, esta marcada com Cyanine 3. A avaliação das laminas da FISH foi realizada em microscópio de fluorescência (Axio Observer A1, Carl Zeiss), pela contagem de 100 espermatozoides por lamina e a observação do número de marcações para cada uma das sondas. O método de incubação, que foi utilizado como controle demonstrou uma taxa de transfecção de 17,80%±1,07. A eletroporação teve 36,70%±2,78 de eficiência, enquanto a taxa de transfecção da PEI foi de 76,8%±3,09, demonstrando que estes métodos foram mais eficientes que a incubação. A eletroporação, apesar da maior taxa de transfecção, este método causou grande taxa de lesão de acrossoma. A polifecção, da mesma forma, teve alta taxa de lesão de acrossoma, bem como de membrana citoplasmática. Devido a isso, é recomendável que os espermatozoides transfectados por estes métodos sejam utilizados em biotécnicas de fertilização, como a injeção intracitoplasmática de espermatozoide.  aEspermatozóide  aOrganismo Transgênico  aReprodução Animal  aSuinocultura  aEletroporação  aPolietilenoimina